Митохондриальная ДНК является мишенью интеграции HBV

Биология связи, том 6, Номер статьи: 684 (2023) Цитировать эту статью

1103 Доступа

5 Альтметрика

Подробности о метриках

Вирус гепатита B (HBV) может интегрироваться в геном инфицированных клеток и способствовать гепатоканцерогенезу. Однако роль интеграции HBV в развитии гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) остается неясной. В этом исследовании мы применяем высокопроизводительный подход к секвенированию интеграции HBV, который позволяет чувствительно идентифицировать сайты интеграции HBV и подсчитывать интеграционные клоны. Мы идентифицировали 3339 сайтов интеграции HBV в парных образцах опухолевых и неопухолевых тканей от 7 пациентов с ГЦК. Мы обнаружили 2107 клонально расширенных интеграций (1817 в опухолевых и 290 в неопухолевых тканях), а также значительное обогащение клональных интеграций HBV в митохондриальную ДНК (мтДНК), преимущественно происходящих в генах окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и области D-петли. Мы также обнаружили, что последовательности РНК HBV импортируются в митохондрии клеток гепатомы с участием полинуклеотидфосфорилазы (PNPASE) и что РНК HBV может играть роль в процессе интеграции HBV в мтДНК. Наши результаты предполагают потенциальный механизм, с помощью которого интеграция HBV может способствовать развитию ГЦК.

Хроническая инфекция вирусом гепатита В (HBV) является основным фактором риска развития гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). По сравнению со здоровыми людьми, пациенты с хроническим гепатитом В (ХГВ) имеют в 100 раз более высокий риск развития ГЦК, который является четвертой по значимости причиной смертности от рака во всем мире, с примерно 780 000 смертей в год1,2. Интегрированная вирусная ДНК была обнаружена в 85–90% случаев ГЦК, связанных с ВГВ, а ее присутствие в опухолях, которые развиваются в нецирротической печени детей или молодых людей, еще раз подтверждает роль интеграции вирусной ДНК в гепатоканцерогенезе3,4,5, 6,7. Интеграция ДНК HBV в геном хозяина может привести к хромосомной нестабильности, инсерционному мутагенезу, нарушению регуляции экспрессии генов хозяина и образованию мутантных вирусных белков, таких как усеченные поверхностные белки и белки HBx с известными онкогенными свойствами8,9. Хотя места инсерции ДНК HBV, по-видимому, распределены случайным образом по всему геному хозяина, недавнее использование подходов секвенирования нового поколения (NGS) привело к выявлению обогащения интеграции HBV в специфические гены, вызывающие рак, включая TERT, MLL4, CCNE1 и CCNA2 – в опухолевых тканях7,10,11,12,13,14,15,16. Более того, недавнее исследование показало, что повторяющиеся изменения числа копий в генах, вызывающих рак, могут быть связаны с отдаленной интеграцией вируса16. Хотя было изучено значительное количество случаев, известные гены, связанные с раком, изменяются в результате интеграции HBV лишь в небольшой части HCC, связанных с HBV. Многочисленные исследования также продемонстрировали, что специфические элементы генома, такие как повторяющиеся последовательности, последовательности ДНК некодирующих РНК и ретротранспозоны, являются мишенью интеграции HBV7,11,12,14,17,18,19. Одно исследование в Гонконге, в котором анализировались HBV-положительные клеточные линии HCC, показало, что экспрессия специфического химерного транскрипта HBx-LINE1 имеет функцию, способствующую развитию опухолей, причем большая часть оцененных HCC экспрессирует этот транскрипт17. Тем не менее, экспрессия HBx-LINE1 не была подтверждена в большой серии ГЦК, связанных с ВГВ, у европейских пациентов20.

Несмотря на прогресс в исследованиях интеграции ДНК HBV, многие ключевые аспекты остаются неясными. В целом, разработка альтернативных методов обнаружения интеграции HBV может помочь лучше понять механизмы, участвующие в канцерогенном процессе, вызванном интеграцией HBV.

Применяя метод высокопроизводительного секвенирования интеграции HBV (HBIS), в этом исследовании мы обнаружили увеличение интеграции вируса в митохондриальную ДНК (мтДНК) как из опухолевых, так и из неопухолевых тканей печени пациентов с ГЦК. Кроме того, мы применили HBIS и RNASeq к митохондриям, очищенным от HBV-индуцированных клеток HepAD38, и обнаружили множественные интеграции HBV в мтДНК, а также транскрипты слияния HBV-митохондрий. Все митохондриальные интеграции в опухолевых тканях были клонально расширены и включали как митохондриальные гены окислительного фосфорилирования (OXPHOS), так и область D-петли. Мы также обнаружили, что последовательности РНК HBV импортируются в митохондрии клеток гепатомы и что полинуклеотидфосфорилаза (PNPASE) может участвовать в импорте вирусных транскриптов.

15 kb, with more than 20% having a length shorter than 100 bp31,46,55. Considering that mtDNA averages several thousand copies per hepatocyte compared to the two copies of numts in nuclear DNA (nDNA), by isolating mitochondria from cells, it is possible to completely dilute out numts, leading to numt-free mtDNA sequences. Therefore, to study mtDNA HBV integration, we isolated nuclei, cytoplasm, and mitochondria from HBV-producing HepAD38 cells and applied both HBIS and RNASeq. According to HBIS, several HBV integration sites were identified in DNA isolated from mitochondria, whereas no integration was detected in numts from nDNA. Furthermore, RNASeq revealed the presence of chimeric HBV-mitochondrial transcripts within mitochondria but not in cytoplasm or nuclei of HBV-producing HepAD38 cells, and mtDNA insertion sites may be transcriptionally active in these cells. Both HBIS and RNAseq analysis also revealed that MMEJ have a major role in HBV integrations occurring in mitochondrial genomes. Therefore, taken together, our data clearly demonstrate that HBV can integrate into mtDNA of tumour and non-tumour hepatocytes. Some previous studies have reported data concerning HBV integration in mtDNA16,56,57,58,59,60. All these studies have utilised high-throughput HBV genome-enrichment sequencing approaches to study HBV integration, and most of them have analysed hepatoma cell lines stably expressing HBV DNA56,57,58,59.To the best of our knowledge, only one16 of the papers has reported data on HBV integration in mtDNA from human liver tissues. In particular, in the supplementary dataset of this paper, 58 different HBV integration sites in mtDNA from tumour and/or non-tumour liver tissue specimens of 11 patients with HBV-related HCC have been listed16. The mitochondrial genomic regions most frequently targeted by HBV integration in the 11 patients were the D-loop region, ND4, ND5, RNR2, CYTB, ND6, ND1, ND2 and COX3 genes16. HBV integration events have also been described in mtDNA from humanised-liver tissue samples of chimeric mice60. In this study, Furuta et al.60 have identified 50 distinct HBV integration sites in mtDNA from chimeric mice. These integrations (a) have been associated with higher levels of HBV replication, (b) occurred at higher frequency in the D-loop region, and (c) appeared to rely on MMEJ60. No detailed information on virus-mtDNA junctions has been provided in studies performed on PLC/PRF/5 cell lines56,59. However, the fact that HBV integration in mtDNA may occur in these cells—which do not replicate HBV and only express multiple distinct viral RNAs from HBV integrants56,59—suggests that viral RNA might be involved in the process of HBV integration in mtDNA. Despite a number of studies documenting interaction between HBV proteins and mitochondria and consequent alteration of mitochondrial functions61,62,63, whether HBV nucleic acids may translocate into mitochondria has only minimally been addressed. Based on our results, HBV transcripts, but not viral full-length genome or cccDNA, can localise to mitochondria. In addition, PNPASE, a mitochondrial protein considered the first RNA import factor for mammalian mitochondria35,36,39, possibly mediates viral RNA delivery into the mitochondrial matrix. A PNPASE-dependent RNA import sequence that we identified for the preS1 transcript as well as known stem-loop structures specific to HBV transcripts appear to mediate mitochondrial targeting of viral RNAs. Localisation of HBV transcripts to mitochondria leads us to hypothesise that viral RNA may represent a possible substrate for HBV integration in mtDNA. The mitochondrial genome is more prone to damage and double-strand break (DSB) formation than the nuclear genome due to frequent exposure to the ROS generated by mitochondrial oxidative phosphorylation and the lack of protective histones. Considering that several reports have shown that RNA molecules can directly act as a template for the repair of mitochondrial DSBs in human cells64, it is tempting to speculate that viral exploitation of this pathway may lead to HBV sequences being inserted into the mitochondrial genome. In summary, we found that HBV may integrate into mtDNA, with tumours and non-tumour liver tissues showing distinct profiles of viral integration into the mitochondrial genome. Moreover, our results indicate that HBV RNA may be actively imported into mitochondria and that viral RNA sequences might be involved in the process of HBV integration into mtDNA. In spite of the relatively limited sample of patients, this study offers new insight into the HBV-hepatocyte interaction and provides a new basis for investigative analyses that may lead to further comprehension of the mechanisms by which HBV insertion can drive HCC development and progression./p> 5 exo− (5000 U/mL) (New England Biolabs, Ipswich, MA) for 1 h at 37 °C. All reactions were purified by a MinElute Reaction Clean-up kit (Qiagen). Each aliquot of blunted, A-tailed DNA fragments was then ligated to 200 pmol annealed linkers (LinkerTop + LinkerBottom) (Supplementary Table 2) with 4 μL pLinker, 5 μL NEB T4 DNA ligase buffer and 1 μL T4 DNA ligase (2 × 106 U/mL, high concentration) (New England Biolabs) for 1 h at 25 °C and then overnight at 16 °C. The ligase was inactivated by incubation at 70 °C for 20 min, and the reactions were purified using a MinElute Reaction Clean-up kit (Qiagen). Finally, all six reactions were pooled, and the pooled linker-ligated DNA was aliquoted into two equal parts to perform semi-nested ligation-mediated PCR with forward or reverse HBV primers (Fig. 1 and Supplementary Table 2). The forward and reverse enrichment sequences were kept separate throughout the remainder of the protocol. The DNA was divided into 1-µg aliquots; each aliquot was mixed with 20 µL Phusion HF buffer (5×), 3 μL dNTPs (10 mM), 1 μL biotinylated forward (20 μM) or reverse HBV primer (Supplementary Table 2) (2.5 μM), 1 μl Phusion Taq (2000 U/ml) (New England Biolabs) and H2O to 50 μL. Single-primer PCRs were performed as follows: 98 °C for 1 min; 12 cycles of 98 °C for 15 s, 65 °C for 30 s and 72 °C for 45 s; 72 °C for 1 min); and a hold at 4 °C. Each tube was then spiked with 1 μL pLinker (Supplementary Table 2) (2.5 μM) and subjected to additional cycles of PCR, as follows: 98 °C for 1 min; 35 cycles of 98 °C for 15 s, 65 °C for 30 s and 72 °C for 45 s; 72 °C for 5 min; and a hold at 4 °C. Forward and reverse PCRs were purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen). The purified products were well separated on a 2% agarose gel, and fragments of 300–1000 bp were excised. The DNA was purified using a QIAquick gel extraction kit, and gel-based size selection and purification was repeated once. Then, 100 μL T1 magnetic streptavidin beads (Invitrogen) were added to each forward and reverse PCR product, and the mixture was incubated for 1 h with gentle rocking at room temperature. The beads were magnetically isolated, washed three times in 500 μL 1× B&W buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) and once in H2O and resuspended in 50 μL H2O. Subsequently, 25 μL of the beads from each of the forward and reverse PCRs were separately mixed with 10 µL Phusion HF buffer (5×), 1.5 μL dNTPs (10 mM), 1 μL forward (20 µM) or reverse MiSeq HBV primer (20 μM), 1 μL forward or reverse MiSeq-pLinker (20 μM) (all MiSeq primers contain an adaptor for Illumina flow cell surface annealing) (Supplementary Table 2), 0.5 μL Phusion Taq (2000 U/mL), and 11 μL H2O and subjected to PCR (98 °C for 1 min, 35 cycles of 98 °C for 10 s, 65 °C for 40 s, and 72 °C–40 s, followed by 72 °C for 5 min and a hold at 4 °C). The PCR products were magnetically separated from the beads and purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen). The adaptor-ligated fragments were enriched by 25 cycles of PCR with Illumina primers Index 1 and Index 2, as follows: 98 C° for 1 min, 25 cycles of 98 °C for 30 s, 55 °C for 30 s, and 72 °C for 30 s), and 72 C° for 5 min. Forward and reverse libraries for the same sample were mixed in equimolar ratios and sequenced by 250-bp paired-end sequencing using an Illumina MiSeq. A total of 340 integration libraries were constructed from liver tissue samples of the nine individuals analysed (7 patients with HBV-related HCC and 2 HBsAg-negative subjects as a control) and from the PLC/PRF/5, HepAD38 and Vero cell lines./p>

3.0.CO;2-E" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1097-0142%28195405%297%3A3%3C462%3A%3AAID-CNCR2820070308%3E3.0.CO%3B2-E" aria-label="Article reference 24" data-doi="10.1002/1097-0142(195405)7:33.0.CO;2-E"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

Новости